En mystisk kraft har splittrat Concordias värld och delat upp den i många utspridda öar, så det är upp till Mario och Luigi att återförena dem. Tillsammans ger de sig ut med Shipshape Island, som är delvis ett skepp, delvis en ö, och använder dess kanon för att skjuta ut sig till en mängd olika öar för att besöka och utforska, med allt från tropiska regnskogar till livliga städer. Under resans gång träffar de två bröderna hjälpsamma nya vänner som Connie och Snoutlet (som definitivt inte är en gris) och bekanta karaktärer från Mushroom Kingdom som Peach och Bowser.
För att återförena Concordia måste spelarna utnyttja kraften i Mario och Luigis broderliga band. För att klara av utmaningar och kringgå hinder använder de två Bros. Moves - som till exempel att forma den mustaschprydda duon till en boll, eller genom att kasta eld- och isbollar för att smälta eller frysa alla hinder. I strid kan spelarna dra nytta av kraftfulla Bros. Attacks som Zapperator i en dynamisk twist på turordningsbaserade strider, där vältajmade attacker, duckningar och motattacker är nyckeln till att besegra fienderna.
Genom att utrusta sig med så kallade Battle Plugs med extra förmågor kan Mario och Luigi dessutom få strategiska fördelar, som att skapa en chockvåg som skadar flera fiender eller garantera kritiska träffar mot flygande fiender. Spelarna kan experimentera med kreativa kombinationer för att skapa olika effekter och se vad som händer.
Luigis uppfinningsrikedom kommer till sin rätt med Luigi Logic, som kan ge en hjälpande hand under både utforskningen och bosstrider. Även om hans idéer ibland kan vara okonventionella hjälper de Mario att lösa pussel, samla föremål och göra stor skada på ännu större fiender.